PCR 扩增
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| SOP 编号 | MB-001 |
| 版本 | v1.2 |
| 作者 | 张三 |
| 审核人 | 李老师 |
| 生效日期 | 2026-10-24 |
使用高保真 DNA 聚合酶扩增目标 DNA 片段，用于克隆或测序。
2. 适用范围
Section titled “2. 适用范围”适用于 0.1–5 kb 片段的常规 PCR 扩增。长片段（> 5 kb）请参考长片段 PCR SOP。
3. 安全注意事项
Section titled “3. 安全注意事项”4. 试剂与耗材
Section titled “4. 试剂与耗材”| 试剂 | 储存条件 | 货号示例 |
|---|---|---|
| 2× 高保真 PCR Master Mix | −20 °C | — |
| 正向 / 反向引物（10 μM） | −20 °C | — |
| 模板 DNA（1–100 ng/μL） | −20 °C | — |
| 无核酸酶水 | 室温 | — |
| 0.2 mL PCR 管 | 室温 | — |
- PCR 仪（热循环仪）
- 微量离心机
- 移液器（0.5–10 μL、2–20 μL、20–200 μL）
6. 操作步骤
Section titled “6. 操作步骤”6.1 配制反应体系（冰上操作）
Section titled “6.1 配制反应体系（冰上操作）”| 组分 | 单管用量 (μL) | 终浓度 |
|---|---|---|
| 2× Master Mix | 25 | 1× |
| 正向引物 (10 μM) | 2 | 0.4 μM |
| 反向引物 (10 μM) | 2 | 0.4 μM |
| 模板 DNA | 1 | 1–100 ng |
| 无核酸酶水 | 补至 50 | — |
| 总计 | 50 |
-
试剂从 −20 °C 取出，冰上融化，短暂离心。
-
按“水 → Master Mix → 引物 → 模板”顺序加样。
-
轻弹混匀，短暂离心收集液体。
-
设置阴性对照管（以水代替模板）。
6.2 设置 PCR 程序
Section titled “6.2 设置 PCR 程序”| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 98 °C | 30 s | 1 |
| 变性 | 98 °C | 10 s | 30 |
| 退火 / 延伸 | 72 °C | 30 s/kb | 30 |
| 终延伸 | 72 °C | 2 min | 1 |
| 保存 | 4 °C | ∞ | — |
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环 |
|---|---|---|---|
| 预变性 | 98 °C | 30 s | 1 |
| 变性 | 98 °C | 10 s | 30 |
| 退火 | Tm − 5 °C | 15 s | 30 |
| 延伸 | 72 °C | 30 s/kb | 30 |
| 终延伸 | 72 °C | 2 min | 1 |
| 保存 | 4 °C | ∞ | — |
6.3 结果检测
Section titled “6.3 结果检测”取 5 μL 产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳（见 50× TAE 缓冲液）。
7. 预期结果
Section titled “7. 预期结果”目标位置出现单一清晰条带，阴性对照无条带。
8. 常见问题
Section titled “8. 常见问题”没有条带
- 检查模板浓度和质量
- 降低退火温度 2–3 °C
- 增加循环数至 35
出现非特异性条带
- 提高退火温度或改用两步法
- 减少模板量或循环数
9. 修订记录
Section titled “9. 修订记录”| 版本 | 日期 | 修订人 | 修订内容 |
|---|---|---|---|
| v1.0 | 2026-01-10 | 张三 | 初版 |
| v1.1 | 2026-05-02 | 王五 | 补充两步法程序 |
| v1.2 | 2026-10-24 | 张三 | 增加常见问题 |